氟苯尼考
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氟苯尼考將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氟苯尼考抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氟苯尼考的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氟苯尼考的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 0.1ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～15min
u 樣本檢測下限
蜂 蜜··············································· 0.1ppb
組 織················································ 5 ppb
牛 奶··············································· 0.2ppb
u 交叉反應(yīng)率
氟苯尼考· ····································· 100%
甲砜霉素 ········································ < 0.1%
氟苯尼考胺 ······································ 11%
氯霉素 ············································ < 0.1%
u 樣本回收率
組 織、蜂 蜜、牛 奶 ······················ 90%±30%
三、試劑盒組成
| 1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
| 2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
| 0.2ppb | 0.4ppb | ||
| 0.8ppb | 1.6ppb | ||
| 3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 |
| 4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍(lán)色帽 |
| 5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
| 6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
| 7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
| 8 | 20X濃縮洗滌液 | 15ml | 白色帽 |
| 9 | 20X濃縮提取液 | 50ml*2 | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液1 樣本提取液：
將20X濃縮提取液用去離子水按1：19稀釋。(1份20X濃縮提取液+19份去離子水)。
配液2 牛奶樣本提取液：
將乙腈與乙酸乙酯按 1:2 比例混合均勻（1份乙腈+2 份乙酸乙酯）。
u 樣本處理：
（a）組織 (雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)樣本處理方法
1、 稱取均質(zhì)后的樣本1±0.05g于50ml離心管中，先加入10ml樣本提取液（配液1），振蕩2min，室溫4000r/min以上離心5min；
2、 取出100µl上層液體加入400µl樣本提取液（配液1），混合均勻；
3、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 50倍
注：如需檢測范圍包含100ppb，可在上述步驟1離心后取出100µl上層液體加入900µl樣本提取液（配液1），混合均勻；取50µl用于分析。
此時，樣本稀釋倍數(shù)為：100倍
（b）蜂蜜處理方法
1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；
2、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥；用1ml樣本提取液（配液1）溶解干燥的殘留物，混合30s；
3、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)： 1倍
（c）牛奶樣本處理方法
1、 吸取牛奶樣本1ml于5ml離心管中， 加 入2ml
牛奶樣本提取液（配液2）振蕩1min，室溫
4000r/min以上離心10min；
2、 取出1ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹干；
3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml
樣本提取液（配液1）混合30s，室溫4000r/min
以上離心5min；去除上層有機(jī)相；
4、 取50 µl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氟苯尼考量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.2ppb為1.415；0.4ppb為0.74；0.8ppb為0.313；1.6ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.8ppb～1.6ppb；樣本2的濃度范圍是0.2ppb～0.4ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟苯尼考實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
| 百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
| B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氟苯尼考實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
9、 組織樣本若檢測結(jié)果高于80ppb，可將樣本進(jìn)行再次稀釋后檢測，結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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