植物葉綠素、類胡蘿卜素含量試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

植物葉綠素、類胡蘿卜素廣泛存在于綠色植物組織中，其含量與光合作用、營養狀況密切相關，是反應植物生長狀況的重要指標。

測定原理

根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C 和液層厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常數。各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數種吸光物質， 則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的最大吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、研缽、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、10mL玻璃試管，錫箔紙。

試劑組成和配制

提取液：液體 1000mL，4℃保存。（自備，無水乙醇：丙酮=1:2） 試劑一：石英砂×1 瓶，4℃保存。

測定操作

1. 稱取約新鮮植物葉片或其它綠色組織，去掉中脈，稱取約 0.1g，剪碎，用蒸餾水洗干凈。

2. 加入1mL蒸餾水，少量試劑一（約 50mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL玻璃試管。

3. 用提取液沖洗研缽，將所有沖洗液轉入玻璃試管，用提取液補充至10mL，玻璃試管置于黑暗條件下或者包上錫箔紙浸提3h，觀察試管底部組織殘渣*變白則提取*，若組織殘渣未*變白，繼續浸提至其*變白。

4. 取浸提液200μL于微量石英比色皿/96孔板，提取液調零，測定663nm、645nm和470nm處吸光值，分別記為A663、A645 和A470。

計算公式

微量石英比色皿計算方法：

葉綠素a含量（mg/g）=（12.7× A663-2.69×A645）×V 提×D÷m÷1000

= 0.01×（12.7×A663-2.69×A645）×D÷m

葉綠素b含量（mg/g）=（22.9×A645-4.68×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.01×（22.9×A645-4.68×A663）×D÷m

葉綠素總含量（mg/g）=（20.21×A645+8.02×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.01×（20.21×A645+8.02×A663）×D÷m

類胡蘿卜素濃度（mg/g）=【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×V 提×D÷m÷1000

=0.01×【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×D÷m

96孔板計算方法：

葉綠素a含量（mg/g）=2×（12.7× A663-2.69×A645）×V 提×D÷m÷1000

= 0.02×（12.7×A663-2.69×A645）×D÷m

葉綠素b含量（mg/g）=2×（22.9×A645-4.68×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.02×（22.9×A645-4.68×A663）×D÷m

葉綠素總含量（mg/g）=2×（20.21×A645+8.02×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.02×（20.21×A645+8.02×A663）×D÷m

類胡蘿卜素濃度（mg/g）=2×【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×V 提×D÷m÷1000

=0.02×【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×D÷m

V 提：提取液體積，10mL；D：稀釋倍數；m：樣本質量，g

注意事項

1. 色素對光敏感，研磨和提取等操作盡量避光或者在弱光下進行。

2. 一定要浸提至組織殘渣*變白，否則提取不充分。

3. 用提取液沖洗研缽一定要沖洗至所有的綠色物質被轉移至玻璃試管。

4. 測定時吸光值超過 1，可進行適當稀釋。

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